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NO:对立结核分枝杆菌的明星分子

时间:2018-08-06编辑: admin 点击率:

  NO:对立结核分枝杆菌的明星分子

  一、研讨布景 结核分枝杆菌感染巨噬细胞后巨噬细胞会发作NO。NO是对立结核分枝杆菌的重要分子,高浓度的NO可杀死结核分枝杆菌,低浓度的NO促进结核分枝杆菌处于埋伏感染,临床上也发现结核病患者呼吸发作的气体中NO含量削减不利于结核病的医治。可是,结核分枝杆菌可经过排泄定位到巨噬细胞细胞核的PPE2蛋白来按捺NO的生成[1]。结核分枝杆菌遭到巨噬细胞NO钳制时PPE2蛋白表达量增多,NO怎么影响该进程现在还不清楚[2]

White B-like(Wbl)蛋白是感知NO的重要蛋白宗族,存在于放线菌、结核分枝杆菌等多种细菌中,该蛋白宗族成员在N端有4个保存的半胱氨酸残基、C端有DNA结合区。结核分枝杆菌编码7种Wbl蛋白分别是WhiB1、WhiB2、WhiB3、WhiB4、WhiB5、WhiB6、WhiB7。WhiB1蛋白,在N端有感知NO的Fe-S簇,Fe-S簇对WhiB1蛋白与转录调控蛋白σA的结合至关重要。结核分枝杆菌感遭到NO后,WhiB1:σA复合领会发作解离,WhiB1、σA进而可调控其他基因的转录[3]。NO影响结核分枝杆菌PPE2的表达,阐明WhiB1、σA可能参加PPE2的转录调控。


 Fig1. WhiB1蛋白结构PPE2蛋白归于PE、PPE蛋白宗族成员,该蛋白宗族成员在其蛋白N端富含脯氨酸、谷氨酸,依据蛋白C端氨基酸序列不同又可细分为PE、PE_PGRS、PPE、PPE-SVP等。许多PE、PPE蛋白宗族成员如PPE36、PPE68、PE_PGRS33、PE_PGRS63、PPE_MPTR34等定位在结核分枝杆菌细胞壁上,这些蛋白的排泄离不开结核分枝杆菌的ESX排泄系统[4,5]。PPE2蛋白能定位到巨噬细胞细胞核,阐明PPE2蛋白是排泄蛋白,其排泄依靠的ESX排泄系统有待深入研讨。
 Fig2. PPE2基因在结核分枝杆菌基因组的方位
 Fig3. ESX排泄系统参加PE、PPE蛋白宗族成员转运Jonathan Braverman等发现NO能作为信号分子按捺NF-kB,按捺炎症因子的生成,可能是IFN-γ发挥抗结核功用的机理之一[6]。PPE2按捺NO生成,可能会导致NF-kB的活化及炎症因子的发作。NF-kB信号通路、炎症因子在结核分枝杆菌感染巨噬细胞及结核分枝杆菌命运中终究发挥何种功用仍需讨论。

 二、相关研讨
 1、NO促进结核分枝杆菌PPE2蛋白表达,PPE2定坐落巨噬细胞细胞核并按捺NO生成
 病原菌感染细胞后能被巨噬细胞发作的活性氧、活性氮等杀死,可是结核分枝杆菌能经过调控巨噬细胞活性氮的生成而逃脱被巨噬细胞杀死的命运。

结核分枝杆菌PPE2蛋白在NO钳制或感染巨噬细胞后表达量升高,标明PPE2可能参加调控巨噬细胞NO生成进程,可是详细机制尚不清楚。NCBI蛋白结构保存域数据库显现PPE2可能是COG5651类蛋白,参加细胞运动和排泄。

Khalid Hussain Bhat等人经过比对PPE家组蛋白序列,发现PPE2蛋白C端473-481方位有核定位信号序列,一起在319-340方位处有亮氨酸拉链结构,这与真核细胞转录因子结构相似,标明PPE2蛋白可能定位到巨噬细胞细胞核并调控inos转录。

在此理论假定前提下,Khalid Hussain Bhat等以M. smegmatis为研讨目标,构建了M. smegmatis  pEGFP-PPE2、pEGFP-∆NLS-PPE2等过表达菌株并感染巨噬细胞,发现PPE2蛋白定坐落巨噬细胞细胞核并能下调巨噬细胞NO的生成,越南信息传媒部官员:越中信息技。证明了假定的准确性[1]。PPE2蛋白排泄需求ESX排泄系统,可是其排泄机制还有待深入研讨。现在还没有PPE2在Mycobacterium tuberculosis H37Rv中的研讨报导。☜感兴趣的朋友可以趁早下手啦
 Fig4. PPE2蛋白定坐落巨噬细胞细胞核

 Fig5. PPE2蛋白能下调iNOS的转录及表达
 2、WhiB1蛋白结合NO研讨
 Bassam K. Kudhair等人体外纯化了WhiB1蛋白,质谱试验标明WhiB1蛋白存在apo-WhiB1、不同Fe-S原子数意图WhiB1、WhiB1[4Fe-4S]等多种形式,其间WhiB1[4Fe-4S]最多,S原子的丢掉可能是WhiB1蛋白发动降解进程的原因,相关机制、参加的酶还不清楚;别的,研讨人员在大肠杆菌中共表达了WhiB1、σA,发现二者可以结合;NO处理WhiB1:σA复合体后,二者发作别离并开释apo-WhiB1,证明NO能与WhiB1 Fe-S结合[3]
 Fig6. NO导致WhiB1:σA复合体别离
 研讨人员还做了WhiB1基因骤变菌株,WhiB1表达量与对照组比较降低了2.7倍,测定转录状况后发现有35个基因转录发作了比较显着的改变,这些基因包含12个假定蛋白、9个脂类代谢相关蛋白、3个转运蛋白、5个中心产品代谢或电子传递链相关蛋白、1个转座酶等。WhiB1骤变对ESX-1排泄相关蛋白转录影响最为显着,别的还影响了PE、PPE蛋白宗族的lipX基因(Rv1169c)[3],这些蛋白都是结核分枝杆菌基础研讨中的热门蛋白。
 Fig7. WhiB1骤变对结核分枝杆菌相关基因的转录影响
 三、研讨计划
 1、WhiB蛋白基因敲除或过表达对结核分枝杆菌PPE2基因表达的影响结核分枝杆菌Mycobacterium tuberculosis H37Rv WhiB 蛋白宗族共有WhiB1-WhiB7七个蛋白,这些蛋白都能与NO结合。A. 构建结核分枝杆菌whiB1-whiB7 七个基因中的单个基因敲除或过表达菌株(研讨显现whiB1为必需基因,敲除有难度);
B. 基因敲除或过表达菌株体外培育,提取mRNA,逆转录PCR测定PPE2转录状况;提取蛋白,western blot验证PPE2表达状况;测定体外成长曲线;
C. 基因敲除或过表达菌株感染巨噬细胞,观测PPE2巨噬细胞细胞核定位状况;测定菌体内成长曲线、巨噬细胞凋亡、炎症因子开释、NO生成量等。
 2、σA基因敲除对结核分枝杆菌PPE2基因表达的影响A. 构建结核分枝杆菌σA基因敲除或过表达菌株(研讨显现σA为必需基因,敲除有难度)B. 基因敲除或过表达菌株体外培育,提取mRNA,逆转录PCR测定PPE2转录状况;提取蛋白,western blot验证PPE2表达状况;测定体外成长曲线;
C. 基因敲除或过表达菌株感染巨噬细胞,观测PPE2巨噬细胞细胞核定位状况;测定菌体内成长曲线、巨噬细胞凋亡、炎症因子开释、NO生成量等。
 3、结核分枝杆菌WhiB蛋白相关结合蛋白研讨A. 大肠杆菌表达纯化WhiB1-WhiB7蛋白中的一种蛋白并对蛋白进行荧光符号;B. 荧光符号的意图蛋白与结核分枝杆菌蛋白芯片孵育、清洗后,芯片扫描仪解读芯片数据,设置适宜cutoff,潜在蛋白进行数据处理并进行GO剖析、pathway剖析;
C. 敲除筛到的结核分枝杆菌基因,体外培育测定成长曲线、与WhiB结合等;感染巨噬细胞,测定菌体内成长曲线、巨噬细胞凋亡、炎症因子开释、NO生成量等。
 【温馨提示】以上计划仅供参考




 参考文献
[1] Bhat KH, Srivastava S, Kotturu SK, Ghosh S, Mukhopadhyay S. The PPE2 protein of Mycobacterium tuberculosis translocates to host nucleus and inhibits nitric oxide production. Sci Rep. 2017 Jan 10;7:39706.
[2] Sangita Mukhopadhyay and Sudip Ghosh. Mycobacterium tuberculosis: what is the role of PPE2 during infection? FUTURE MICROBIOLOGYVOL. 12, NO. 6.
[3] Bassam K. Kudhair, Andrea M. Hounslow, Matthew D. Rolfe, Jason C. Crack, Debbie M. Hunt, Roger S. Buxton, Laura J. Smith, Nick E. Le Brun, Michael P. Williamson1 & Jeffrey Green. Structure of a Wbl protein and implications for NO sensing by M. tuberculosis. Nat Commun. 2017 Dec 22;8(1):2280.
[4] S. Fishbein, N. van Wyk, R. M. Warren and S. L. Sampson. Phylogeny to function: PE/PPE protein evolution and impact on Mycobacterium tuberculosis pathogenicity. Molecular Microbiology (2015) 96(5), 901–916.
[5] Matthias I. Grchel, Fadel Sayes, Roxane Simeone, Laleh Majlessi and Roland Brosch. ESX secretion systems: mycobacterial evolution to counter host immunity. NATURE REVIEWS  MICROBIOLOGY, VOLUME 14 NOVEMBER 2016 691.
[6] Jonathan Braverman and Sarah A. Stanley. Nitric Oxide Modulates Macrophage Responses to Mycobacterium tuberculosis Infection through Activation of HIF-1a and Repression of NF-kB. J Immunol. 2017 Sep 1;199(5):1805-1816.

 

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